pPIC9K转化酵母时为什么要线性化，不同的酶切位点的产生的线性化的酵母的表性为什么不同？谢谢了

pPIC9K转化酵母时为什么要线性化，不同的酶切位点的产生的线性化的酵母的表性为什么不同？谢谢了

线性化方便目的基因的插入重组，我们一般在Sal1位点线性化，否则不能通过同源重组整合到酵母的基因组上。一般来说，选SacⅠ线性化整合，重组率要高一些

不同的酶切位点的产生的线性化的酵母的表性如下

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的:为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG-pPIC9K, 转化嗜甲醇酵母. 方法:根据βhCG的cDNA 序列设计两条引物,使上游带EcoR I酶切位点,下游带Not I酶切位点,以质粒βhCG-PBS KS为模板,进行PCR扩增反应;将所得的DNA片段经EcoR I和Not I双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接,然后导入大肠杆菌DH5α,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG-pPIC9K. 再用电打孔法转化酵母(Pichia pastoris),用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G418的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株. 结果:用所设计的引物扩增出两端分别带EcoR I 和Not I酶切位点的βhCG DNA片段,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆,经PCR 反应和双酶切鉴定表明重组质粒是βhCG-pPIC9K,并转化嗜甲醇酵母获得耐受4 mg/mL G418的菌株. 结论:构建了重组质粒βhCG-pPIC9K并获得插入重组质粒βhCG-pPIC9K的嗜甲醇酵母.

线性化酵母前后跑对比电泳。切开后的条带应该跑的慢，完整质粒跑在前面，如果酶切不完全，那么线性化后的泳道就有两个条带，其中一个同质粒相同。

还有就是氯仿、乙醇回收法是可行的。

1.加等体积等酚氯仿，轻轻颠倒混匀，10000g离心5min，取上清，重复加酚氯仿抽提三次。

2.加2.5倍体积等无水乙醇何1/10等3M NaAc，混匀，10000g离心2min，去上清。

3.沉淀加80％乙醇，润洗，10000g稍离心，去上清，重复三次。

4.自然干燥，加10ul（50ul的酶切体积）无酶水，取1ul稀释10倍电泳检测，其余-80℃保存